本規(guī)范適用于非洲豬瘟病毒流行毒株與非洲豬瘟病毒CD2v和MGF 360-505R基因缺失株的熒光PCR方法鑒別檢測。

主要試劑

核酸提取試劑盒。

無核酸酶水。

熒光PCR預混液（2×）。

引物和探針：P72、CD2v、MGF360-505R基因擴增引物和探針由國家非洲豬瘟參考實驗室設計并提供（聯(lián)系人：李林，電話：0532-87839188）。  

陽性和陰性對照：陽性對照樣品為ASFV基因組DNA標準物質（用無核酸酶水稀釋1000倍后使用），由國家非洲豬瘟參考實驗室提供；陰性對照樣品為無核酸酶水。

主要儀器設備

熒光PCR擴增儀。

臺式低溫高速離心機。

組織勻漿機。

微量可調移液器（2.5 μL、10 μL、100 μL、200 μL、1000 μL等不同規(guī)格）。

無核酸酶離心管與吸頭。

PCR擴增管。

樣品采集和運輸保存

對活豬，可采集抗凝全血（EDTA抗凝）、口鼻拭子或血清等；對病死豬或已屠宰豬，可采集脾臟、淋巴結、扁桃體、肝臟等組織。盡快送至實驗室進行病毒核酸檢測。

樣品的運送與保存應滿足NY/T 541《獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運輸技術規(guī)范》相關要求。上述樣品可在4°C最長保存2天；如需長時間保存，應置于-20°C以下。

樣品處理

組織樣品

取0.1 g～0.2 g樣品，加入1 mL～2 mL預冷的PBS（pH 7.4），用組織勻漿機高速勻漿，制成10%組織勻漿液，以5000 r/min離心10 min，取200 μL上清液進行核酸提取。

液體樣品

抗凝全血、血清等液體樣品不需進行特殊處理，直接取200 μL進行核酸提取。

病毒核酸的提取和純化

取已進行前處理的樣品200 μL，可按傳統(tǒng)方法提取病毒核酸，也可采用病毒核酸提取試劑盒、自動化核酸提取儀提取病毒核酸。提取后的病毒核酸應立即使用或置于-20°C以下冷凍保存。每次抽提核酸，應包括一個陽性對照樣品和一個陰性對照樣品。

熒光PCR檢測

熒光PCR反應液制備

在滅菌的離心管中制備符合檢測樣品數(shù)量（包括陽性、陰性對照）要求的熒光PCR反應混合液，至少額外制備兩個樣品的量。每個樣品配制20 μL PCR反應混合液，組成如下：7.5 mL P72、CD2v、MGF360-505R基因引物、探針預混液（P72、CD2v、MGF360-505R基因探針分別用FAM、VIC和Cy5進行標記）、12.5 mL 2×探針法熒光PCR預混液。

分別取20 μL PCR反應混合液加至每個PCR擴增管中；再分別取5 μL DNA模板加入到PCR擴增管中。每次進行熒光PCR擴增時均應設立陽性、陰性對照。陽性對照應用陽性對照樣品所提取核酸作為模板，陰性對照應用陰性對照樣品所提取核酸作為模板。加入模板后，密封PCR擴增管，瞬時離心。將所有PCR擴增管放在熒光PCR儀中。按下述條件運行擴增程序。

熒光PCR擴增條件

50°C孵育2min；95°C預變性5min；95°C變性15s，60°C退火延伸1min，45個循環(huán)，在每一循環(huán)的60°C時收集FAM、VIC和Cy5通道中的熒光信號。

結果分析

Ct值由熒光PCR儀的軟件自動確定。

試驗成立條件

陽性對照P72、CD2v、MGF 360-505R基因的Ct值均＜35且出現(xiàn)特異性擴增曲線，陰性對照P72、CD2v、MGF 360-505R基因無Ct值或陰性對照P72、CD2v、MGF 360-505R基因Ct值≥40且無特異性擴增曲線，判為試驗有效。試驗無效時應重新進行試驗。

P72、CD2v、MGF 360-505R基因檢測結果判定

P72基因檢測結果判定（FAM通道）

被檢樣品Ct值≤38且出現(xiàn)特異性擴增曲線，判為ASFV P72基因檢測陽性；無Ct值或Ct值≥40，判為ASFV P72基因檢測陰性；38＜Ct值＜40且出現(xiàn)特異性擴增曲線，判為疑似。對疑似樣品，再進行1次復檢，做3個重復；至少2個重復Ct值＜40且出現(xiàn)特異性擴增曲線即判為ASFV P72基因檢測陽性，否則判為ASFV P72基因檢測陰性。

CD2v基因檢測結果判定（VIC通道）

被檢樣品Ct值≤38且出現(xiàn)特異性擴增曲線，判為ASFV CD2v基因檢測陽性；無Ct值或Ct值≥40，判為ASFV CD2v基因檢測陰性；38＜Ct值＜40且出現(xiàn)特異性擴增曲線，判為疑似。對疑似樣品，再進行1次復檢，做3個重復；至少2個重復Ct值＜40且出現(xiàn)特異性擴增曲線即判為ASFV CD2v基因檢測陽性，否則判為ASFV CD2v基因檢測陰性。

MGF 360-505R基因檢測結果判定（Cy5通道）

被檢樣品Ct值≤38且出現(xiàn)特異性擴增曲線，判為ASFV MGF 360-505R基因檢測陽性；無Ct值或Ct值≥40，判為ASFV MGF 360-505R基因檢測陰性；當38＜Ct值＜40且出現(xiàn)特異性擴增曲線，判為疑似。對疑似樣品，再進行1次復檢，做3個重復；至少2個重復Ct值＜40且出現(xiàn)特異性擴增曲線即判為ASFV MGF 360-505R基因檢測陽性，否則判為ASFV MGF 360-505R基因檢測陰性。

綜合判定

結合P72、CD2v、MGF 360-505R等3個基因的檢測結果進行綜合判定。具體判定標準見附表。

附表   綜合判定標準

注：“+”代表檢測陽性；“-”代表檢測陰性